Das Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Mikroskop

Das Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop, das Winfried Denk in den späten 1980er Jahren gemeinsam mit Jim Stricker und Watt Webb entwickelt hat [1], ist heute in vielen biomedizinischen Forschungslaboren zu finden. Das Revolutionäre an diesem Mikroskop: Erstmals konnten mit ihm Zellen mit erstaunlicher Klarheit vergleichsweise tief im lebenden Gewebe und über längere Zeitspannen hinweg beobachtet werden.

Die Grundlage des Mikroskops bildet ein Laserstrahl, der ultrakurze, intensive Laserpulse mit sehr hoher Photonendichte aussendet. Treffen zwei Photonen zeitgleich auf ein Fluoreszenzmolekül, können sie dieses entsprechend anregen. Die Anregung erfolgt sehr fokussiert und nur im Fokusbereich des Laserstrahls. So wird das Gewebe geschont und vor Ausbleichen und Fototoxizität bewahrt. Die Fluoreszenzanregung erfolgt beim Zwei-Photonen-Mikroskop mit Licht im tiefroten oder infraroten Bereich.

Fluoreszenz

Fluoreszenz ist, wenn ein Farbstoffmolekül ein ankommendes Photon absorbiert und daraufhin ein anderes Photon wieder abgibt. In der klassischen Fluoreszenzmikroskopie vor der Erfindung des Zwei-Photonen-Mikroskop geschah diese Anregung durch jeweils genau ein Photon. Das kurzwellige, hoch-energetische Licht (häufig blau oder ultraviolett) regt ein Elektron des Fluoreszenzfarbstoffs an. Das Elektron bleibt für einige Nanosekunden auf einem höheren Energieniveau und fällt dann zurück in seine Ausgangsposition. Dabei wird ein anderes, länger-welliges und somit energieärmeres Photon ausgesendet. So entsteht zum Beispiel grüne Fluoreszenz, wenn mit blauem Licht angeregt wird.

Bei extrem hoher Lichtintensität, wie im Fokus eines gepulsten Laserstrahls, kann ein Fluoreszenzmolekül auch einmal zwei Photonen absorbieren. Das daraufhin abgegebene Photon enthält dann beinahe die doppelte Energie. Auf diese Weise ist es möglich, ein Molekül auch mit energieärmerem, roten Licht zu einem (grünen) Leuchten anzuregen. Gleich neben dem Fokuspunkt ist die Intensität des verwendeten roten Lichts schon wieder zu gering für diesen Zwei-Photonen Effekt. So wird das bestrahlte Gewebe außerhalb des Fokuspunktes vor dem Ausbleichen geschützt und Aufnahmen auch in großer Tiefe und über längere Zeiträume möglich.

Tiefe Einblicke

Mit der traditionellen Fluoreszenzmikroskopie können nur dünne Präparat-Schnitte, also totes Gewebe, betrachtet werden. In dickerem Gewebe verhindert die Streuung und Brechung des Lichts durch die umgebenden Strukturen den Blick in tiefer gelegene Schichten, und es können nur Details bis zu einer Tiefe von 50-80 µm betrachtet werden. Dagegen erlaubt die Zwei-Photonen-Mikroskopie Untersuchungen im lebenden Gewebe und, durch die stark fokussierten Lichtimpulse, können auch Objekte untersucht werden, die bis zu 1000 µm tief im Gewebe liegen.

Ein Hauptanwendungsgebiet der Zwei-Photonen-Mikroskopie ist die Neurobiologie. Im Gehirn und Nervensystem sind die Zellen intensiv miteinander vernetzt und streuen dadurch das Licht besonders stark. Gerade in diesem Forschungsbereich konnte die Zwei-Photonen-Mikroskopie somit völlig neuartige Einblicke in das intakte Gewebe eröffnen und ermöglicht Rückschlüsse auf das Verhalten von Nervenzellen unter physiologischen Bedingungen.